Регуляция секреции соляной кислоты в желудке

Молекулярные механизмы регуляции секреции соляной кислоты слизистой оболочки желудка

О.Д. Лопина, А.А. Котлобай, А.М. Рубцов
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

В проникновении соляной кислоты через апикальную мембрану участвует многокомпонентная транспортная система (рис. 1). Основным элементом этой системы является протонный насос, обеспечивающий АТФ-зависимый обмен внутриклеточных Н+ на внеклеточные К+ [7]. Оба иона переносятся против электрохимического градиента. Из клетки К+ выходят по градиенту, по-видимому, через специальный канал, причем выход этого катиона сопровождается выходом из клетки Cl-. Таким образом, суммарным результатом работы этой транспортной системы являются секреция соляной кислоты в люминальное пространство и циклическое перемещение ионов калия из клетки наружу и в обратном направлении. Cl- входят в клетку через базолатеральную мембрану. В транспорте этого аниона принимает участие НСО3-, /Cl- -анионный обменник. Необходимые для такого обмена НСО3– образуются в клетке в результате работы специального фермента карбоангидразы, обеспечивающего синтез Н2СО3 из углекислого газа, который появляется в клетке в результате метаболических процессов, и воды. Н+, образующийся при диссоциации Н2СО3, секретируется протонным насосом в люминальное пространство. Карбоангидраза локализована в клетке в непосредственной близости от системы внутриклеточных канальцев. При интенсивной работе насоса, когда начинает ощущаться нехватка Н+ внутри клетки, в процесс включаются также встроенные в базолатеральную мембрану катионобменники (К+/Н+ или Na+/Н+), обменивающие внеклеточные Н+ на внутриклеточные К+ или Na+. Таким образом, присутствие дополнительных переносчиков, находящихся на базолатеральной мембране, обеспечивает трансэпителиальный транспорт Cl- и частично Н+.

Роль протонного насоса в системе, обеспечивающей секрецию соляной кислоты, выполняет Н+, К+-АТФаза – фермент, относящийся к семейству АТФаз Р-типа [7]. Ближайшим “родственником” этого фермента является Na+, К+-АТФаза, которая вместе с Н+, К+-АТФазой образует отдельное подсемейство. Кроме эпителиальных клеток желудка, Н+, К+-АТФаза (по-видимому, ее изозим) встречается также в эпителиальных клетках почечных канальцев и в эпителии некоторых отделов кишечника.

Н+, К+-АТФаза локализована в апикальной мембране, тогда как Na+, К+-АТФаза сосредоточена исключительно в базолатеральной мембране. Как и Na+, К+-АТФаза, Н+, К+-АТФаза состоит из субъединиц двух типов: a-субъединицы – полипептида с молекулярной массой около 100 кДа (1033 аминокислотных остатка), выполняющего каталитическую функцию, и b-субъединицы – гликопротеида с невыясненной до конца функцией, молекулярная масса которого составляет 50 – 60 кДа (291 аминокислотный остаток; остальная часть молекулы, примерно 1/3 часть по массе, представлена углеводными фрагментами). В настоящее время определена аминокислотная последовательность как a- [9], так b-субъединиц [10], а также установлено расположение полипептидных цепей этих белков в мембране (рис. 2, А). Полипептидная цепь a-субъединицы несколько раз пересекает мембрану, образуя 5 трансмембранных петель. N- и С-концы a-субъединицы находятся в цитоплазме. Большая часть полипептидной цепи (около 800 аминокислот) образует большой цитоплазматический домен, в котором расположен активный центр фермента, где и происходит гидролиз АТФ. Катионы перемещаются через мембрану по каналу, который формируется трансмембранными петлями. N-конец b-субъединицы находится внутри цитоплазмы, ее полипептидная цепь пересекает мембрану только один раз. Большая часть р-субъединицы располагается с внеклеточной стороны мембраны. На ней расположены участки, подвергающиеся гликозилированию.

АТФазы Р-типа осуществляют гидролиз АТФ до АДФ и неорганического фосфата. Высвобождающаяся в процессе гидролиза энергия используется для переноса катионов через мембрану против электро- химического градиента. Характерной особенностью АТФаз Р-типа является образование в процессе каталитического цикла фосфорилированного интермедиата (фосфорилированию подвергается остаток аспарагиновой кислоты, расположенный на a-субьединице; в Н+, Н+, К+-АТФазе это Asp-385). Вторая особенность этого семейства АТФаз заключается в том, что в процессе гидролиза АТФ фермент пребывает в двух основных конформациях – Е1 и Е2, которые различаются по сродству к переносимым катионам. Конформация Е1 имеет высокое сродство к Н+, а конформация Е2 – к катионам К+. Схема гидролиза АТФ Н+, К+-АТФазой представлена на рис. 2, Б. В конформации Е1 со специфическими центрами, расположенными на цитоплазматической поверхности мембраны, связывается H+, после чего происходит фосфорилирование Asp-385, расположенного в активном центре фермента (образование Е1-Р). После фосфорилирования закрываются створки канала, находящиеся на цитоплазматической стороне мембраны. Затем протоны перемещаются через мембрану, что приводит к изменению конформации фермента (переход Е1-Р в Е2-Р). В этом состоянии открываются створки канала с люминальной (внеклеточной) стороны. После этого протоны высвобождаются из катионсвязывающих участков фермента, а К+ связываются с катионсвязывающими центрами на люминальной поверхности мембраны. Связывание К+ с Е2-Р-формой фермента активирует гидролиз ацилфосфатной связи и высвобождение неорганического фосфата. Вслед за этим закрываются створки канала с внеклеточной стороны и ионы калия с внеклеточной поверхности мембраны перемещаются на цитоплазматическую. Связывание АТФ приводит к тому, что происходит изменение конформации фермента (из Е2 переходит в Е1) и К+ высвобождаются в цитоплазму, после чего цикл может повториться. Обмен Н+ на К+, осуществляемый Н+, К+-АТФазой, является электронейтральным. Возникающая в результате работы протонного насоса разница в концентрации Н+ по разные стороны апикальной мембраны составляет 106. Это самый большой градиент концентраций, создаваемый известными в настоящее время системами активного транспорта.

Активность Н+, К+-АТФазы специфически подавляется омепразолом и другими соединениями (лансопразол, пантопразол), являющимися замешенными производными бензимидазола. Эти соединения, накапливаясь в кислых компартментах, главным образом во внутриклеточных канальцах париетальных клеток, связывают Н+ и превращаются в собственно ингибитор, который ковалентно (необратимо) взаимодействует с SH-группами белка, расположенными на люминальной поверхности апикальной мембраны [8]. Восстановление активности Н+, К+-АТФазы после обработки омепразолом происходит главным образом по мере синтеза новых молекул фермента, поэтому длительность вызванного им ингибирования зависит от скорости обновления фермента (половина молекул Н+, К+-АТФазы человека обновляется за 30-48 ч). Кроме того, известны нековалентные (обратимые) ингибиторы Н+, К+-АТФазы [6]. Среди них наиболее изучен имидазопиридин SCH- 28080. Это соединение взаимодействует с К-связывающим участком фермента. Длительность действия этих соединений на Н+, К+-АТФазу зависит главным образом от продолжительности жизни самого соединения, а не фермента.

Кроме Н+, К+-АТФазы, в секреции соляной кислоты участвуют компоненты, обеспечивающие транспорт К+ по градиенту концентраций и сопряженный с ним выход Cl- против градиента концентраций. Транспорт Cl- осуществляется через специальный хлорный канал. В настоящее время этот канал идентифицирован [5]. Он представляет собой белок с молекулярной массой около 100 кДа (898 аминокислот) и по структуре похож на каналы семейства СlС-2, которые присутствуют в мозге и сердце (гомология между хлорным каналом из слизистой оболочки желудка кролика и СlС-2 хлорным каналом из мозга крысы составляет 93%). Проводимость канала равна 7pS при концентрации CsC1 150 мМ с обеих сторон мембраны. Через канал, кроме Cl-, могут проходить и другие анионы. Селективность канала для анионов уменьшается в ряду I-, Cl-, Br-, NO3. Канал является потенциал- и рН-зависимым. Изменение потенциала от 0 до – 80 мВ приводит к 10-кратному увеличению проводимости канала. При потенциале – 80 мВ и внутриклеточном рН 7,4 снижение рН вне клетки до 3,0 дополнительно увеличивает проводимость канала в 5-6 раз.

К+ покидают клетку, по-видимому, через специальный калиевый канал. Установлено, что секрецию соляной кислоты тормозит тетраэтиламмоний, который известен как ингибитор калиевых каналов. Однако в отличие от Cl-канала, структура которого хорошо изучена, калиевый канал идентифицирован только в электрофизиологических экспериментах.

Для выяснения молекулярных механизмов, обеспечивающих активацию секреции соляной кислоты, необходимо выяснить последовательность процессов, происходящих после связывания молекулы секретогена с рецептором, расположенным на поверхности париетальной клетки. В течение многих лет было известно, что париетальная клетка содержит как минимум рецепторы двух типов: гистаминовые H2-рецепторы и мускариновые M3,-рецепторы для ацетилхолина. До недавнего времени не было данных о рецепторе для гастрина. Считалось, что гастриновые рецепторы находятся на энтерохромаффинных клетках, которые после связывания гастрина высвобождают гистамин. Выделяющийся из энтерохромаффинных клеток гистамин связывается с H2-рецепторами париетальных клеток, обеспечивая стимуляцию секреции. Однако недавно было показано, что и париетальные клетки содержат гастриновые рецепторы [11]. Рецептор для гастрина относится к типу В-рецепторов для холецистокинина (ССК-В). Рецепторы этого типа, как и находящиеся на поверхности париетальных клеток М,-рецепторы, обеспечивают свое действие через О-белки, активирующие фосфолипазу С. Этот фермент гидролизует фосфоинозитиды, находящиеся в липидном слое мембраны. По-видимому, образующийся в результате гидролиза инозитолтрифосфат вызывает выход Са2+ из внутриклеточных депо (эндоплазматический ретикулум), в результате чего внутриклеточная концентрация Са2+ увеличивается. Второй продукт этой реакции диацилглицерол вместе с Са2+ активирует Са, фосфолипидозависимую протеинкиназу (протеинкиназа С), которая в свою очередь фосфорилирует белки мишени, влияя на их функциональную активность. Таким образом, в результате активации париетальных клеток под действием как гастрина, так и ацетилхолина могут происходить увеличение внутриклеточной концентрации Са2+ и фосфорилирование белков-мишеней под действием протеинкиназы С. Однако вся цепь событий для париетальной клетки не прослежена. Известно лишь, что активация секреции соляной кислоты париетальными клетками под действием гастрина и ацетилхолина приводит к повышению концентрации вторичного мессенджера цГМФ. Возможные начальные этапы процесса активации секреции париетальными клетками представлены на рис. 3.

Наиболее изучена активация секреции соляной кислоты под действием гистамина. Связываясь с H2- рецептором, этот секретоген через О-белки активирует аденилатциклазу, в результате чего повышается внутриклеточный уровень цАМФ [1]. Вслед за этим происходит повышение внутриклеточной концентрации Са2+: он входит в клетку через плазматическую мембрану. Париетальные клетки содержат цАМФ-зависимые протеинкиназы (протеинкиназы А) двух типов – I и II. Установлено, что мишенями для цАМФ-зависимых протеинкиназ является большое количество как цитоплазматических, так и мембранных белков. Одной из идентифицированных мишеней протеинкиназы А является Cl-канал. В системе in vitro установлено, что фосфолирование канала этой протеинкиназой приводит к увеличению его проводимости. В экспериментах с мембранными везикулами, полученными из стимулированных гистамином и несекретирующих (обработанных антагонистом H2-рецептора циметидином) париетальных клеток, было показано, что скорость секреции соляной кислоты в несекретирующих клетках лимитируется не активностью Н+, К+-АТФазы, а проницаемостью Cl-канала. Таким образом, фосфорилирование Cl-канала протеинкиназой А устраняет лимитирующую стадию в процессе секреции соляной кислоты.

В несекретирующих париетальных клетках большая часть Н+, К+-АТФазы является неактивной и сосредоточена в везикулах, расположенных в цитоплазме неподалеку от апикальной поверхности мембраны (так называемые тубуловезикулы). Активация секреции сопряжена в первую очередь с перемещением этих везикул к поверхности апикальной мембраны или мембраны канальцев и с их слиянием с этими мембранами. Этот процесс сопровождается увеличением количества молекул Н+, К+-АТФазы на единицу поверхности мембраны. Активное участие в этом процессе принимает цитоскелет париетальной клетки: обработка клеток цитохалазинами А и Е, которые блокируют удлинение микрофиламентов, предотвращает активацию секреции. Известно, что около 4% белка париетальной клетки представлено актином и около 60% актина находится в полимеризованной F-форме [3]. Нити полимеризованного актина, сшитые друг с другом специальными белками цитоскелета, располагаются внутри микроворсинок апикальной поверхности мембраны, формируя своеобразный скелет. Другие белки цитоскелета сшивают нити актина с белками, встроенными в мембрану. Активация секреции сопряжена с перемещением актина к поверхности апикальной мембраны, а миозина – ближе к центру клетки. По-видимому, среди фосфорилируемых протеинкиназой А белков париетальных клеток немало белков цитоскелета. В частности, среди мишеней протеинкиназы А идентифицирован периферический белок мембраны эзрин с молекулярной массой 80 кДа, который участвует в связывании актиновых микрофиламентов с мембраной [4].

При стимуляции клетки гистамином наблюдается перераспределение белков между цитоплазмой и мембраной. Удалось обнаружить белки, которые при активации секреции перемещаются из цитозоля в мембрану и специфически взаимодействуют с Н+, К+-АТФазой. Известно, что Н+, К+-АТФаза, как и другие АТФазы P-типа, ингибируется мелитгиномпептидом из яда пчелы, состоящим из 26 аминокислот. Имеющиеся в настоящее время данные позволяют предполагать, что мелиттин имитирует определенную детерминанту, участвующую в белок-белковых взаимодействиях в клетке. При использовании антител на мелиттин в цитозоле несекретирующих париетальных клеток был обнаружен белок с молекулярной массой 67 кДа. Этот белок взаимодействует с антителами на мелиттин и, следовательно, содержит участки, по структуре похожие на мелиттин. При стимуляции париетальных клеток гистамином мелиттиноподобный белок перемещается из цитозоля в мембрану [2]. Белок был получен в чистом виде, и в экспериментах in vitro установлено, что он специфически взаимодействует с Н+, К+-АТФазой. Однако пока неизвестно, что является сигналом для перемещения мелиттиноподобных белков при стимуляции, а также какова их функция. Не исключено, что они также являются белками цитоскелета, осуществляющими взаимодействие Н+, К+-АТФазы с микрофиламентами. Полученная в последние годы информация позволяет считать, что белки, обеспечивающие связывание мембранных белков с цитоскелетом, зачастую не только являются структурным элементом, но и участвуют в передаче сигнала. Таким образом, мелиттиноподобный белок, перемещающийся в мембрану при стимуляции секреции, может оказаться и активатором Н+, К+-АТФазы.

Завершая обзор экспериментальных данных, можно сделать следующее заключение: несмотря на то что представление о молекулярных механизмах активации секреции соляной кислоты значительно расширилось, детальное изучение этого процесса лишь начинается и в ближайшее время можно ожидать появления новых интересных фактов.